新型温敏无机焦磷酸酶复合物的合成及其在聚合酶链反应改进中的应用

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(1)定点诱变构建无机焦磷酸酶变体:一种合成温敏无机焦磷酸酶复合物的新方法,包括在无机焦磷酸酶活性中心附近引入巯基方法。无机焦磷酸酶突变体。(2)热敏聚合物聚-N-异丙基丙烯酰胺的制备:控制N-异丙基丙烯酰胺单体与链转移剂的比例,并聚合得到不同分子量的N-异丙基丙烯酰胺聚合物的聚合物。(3)形成硫代吡啶基的聚合物:聚合物末端的改性硫代吡啶基。(4)聚-N-异丙基丙烯酰胺无机焦磷酸酶复合物:控制硫代吡啶基修饰聚合物与无机焦磷酸酶突变体的比例,以及无机焦磷酸酶突变体活性中心附近的硫代吡啶和巯基通过反应耦合。PNI-PPasa)
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2.根据权利要求1所述的合成方法,其中步骤(1)的硫醇基团通过定点诱变引入,即在活性中心附近引入半胱氨酸巯基。在无机焦磷酸酶和无机焦磷酸酶活性中心附近引入巯基。
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2.根据权利要求1的方法,其中步骤(2)中的聚合是可逆加成断裂链转移聚合。
4?
2.根据权利要求1的方法,其中在步骤(3)中,在步骤(2)中,将硫代吡喃基改性的聚合物加入到聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物中。二硫。
5?
2.根据权利要求1的合成方法,其特征在于获得缀合物(PNI-PPase)并测量聚合酶链式反应器在不同时间点的活性变化。(1)将缀合物(PNI-PPase)置于聚合酶链式反应器中20至100个循环。焦磷酸钠(Na 4 P 2 O 7)用作底物以确定缀合物在不同循环中的活性。
6?
根据权利要求1的缀合物应用于聚合酶链式反应的方法,其特征在于将缀合物(PNI-PPase)加入聚合酶链反应系统中以改善其促进作用。。DNA聚合酶链反应的效率|文章信息| J-GLOBAL
7?
7.根据权利要求6的方法,其特征在于将缀合(PNI-PPase)加入聚合酶链反应系统中以提高聚合酶链反应的效率。以下步骤:(1)将缀合物(PNI-PPase)加入到聚合酶链式反应系统中,并使系统循环数次。(2)通过琼脂糖凝胶电泳表征扩增的聚合酶链反应。
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2.根据权利要求1的缀合物在不同温度下的活性测定和在不同时间的热稳定性测试,其包括:(1)在25℃下测定缀合物(PNI-PPase)。在90℃下的比活度值:焦磷酸钠(Na 4 P 2 O 7)作为底物,用于在一定时间内测定缀合物(PNI-PPase)的磷酸盐含量,以及相应的特定活性温度计算方式。(2)测量缀合物(PNI-PPase)在约60℃的温度下的热稳定性:在60℃下热处理不同时间并测定缀合物(PNI-PPase)的活性。
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9.根据权利要求8的缀合物应用于聚合酶链式反应的方法,其特征在于它还包括选择和应用聚合酶链式反应的方法。将最好的热稳定缀合物(PNI-PPase)加入到聚合酶链反应系统中并在聚合酶链式反应系统中循环数次。